本文所谈的滤光片指的是各种荧光滤光片，滤光片一般用于各种显微镜中，使人们能够更方便的观测各种荧光现象。滤光片通常用到的显微镜有荧光显微镜、激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）、共聚焦显微镜、和全内反射荧光显微镜（TIRFM）。

1，滤光片的原理

荧光滤光片一般采用单片无色透明的玻璃作为基底，在玻璃的两个表面镀膜。增反膜的

厚度会选择为半波长的整数倍，此时反射叠加增强；增透膜的厚度为1/4 波长的倍数，此时

投射叠加增强。

2，滤光片的分类方法

根据使用目的的不同，滤光片可分为TIRF 滤光片、干涉滤光片、全内反射滤光片、Raman滤光片、拉曼滤光片、FISH 荧光滤光片和应原位杂交滤光片。

根据滤光片本身功能的不同，其可分为激发滤光片、发射滤光片、二向色镜/二向色滤光片/二色镜、陷波滤光片、燃料滤光片、荧光素滤光片、ND 滤光片、中性滤光片、中性灰度镜、截止滤光片、高通滤光片、低通滤光片、带通滤光片、紫外滤光片和UV 滤光片。

根据主要应用领域，滤光片又可分为生物滤光片、医学滤光片和天文学滤光片。

1）荧光滤光片Fluorescence Filters

用于生命科学和生物医学领域，主要作用是在生物医学荧光检验分析系统中分离和选择物质的激发光与发射荧光的特征波段光谱。

2）中性灰度镜ND 滤光片

中性灰度镜（neutral density filter）又叫中灰密度镜，其作用是均匀地过滤光线。这种滤光作用是非选择性的，也就是说，ND 镜对各种不同波长的光线的减少能力是同等的、均匀的，而对原物体的颜色不会产生任何影响，可以真实再现景物的反差。

3）荧光原位杂交滤光片，FISH 滤光片

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA 序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA 分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。

4）陷波滤光片，Notch 滤光片

陷波滤光片通常用于拉曼光谱测试。通常也被称作带阻或者带抑制滤光片。它可以透过绝大多数波长，但是将特定波长范围内（阻带）的光衰减到非常低的水平。

5）全内反射滤光片（TIRF 滤光片） 

全内反射荧光法滤光片用于全内反射荧光法显微镜，利用全内反射产生的隐失波照明样品, 使照明区域限定在

样品表面的一薄层范围内，从而观测到非常不易察觉的现象。

3，滤光片的激发和成像方式

荧光滤光片的激发和成像方式大体可分为如下三种：

聚焦型：入射激发光聚焦在待测样品上；

宽场型：入射激发光束以较大的面积打到样品上

全内反射型（TIRF）：激发光透过样品，观测倏逝波成像

4，滤光片组和滤光片盒子（Filter sets）

滤光片在实际中一般都是以滤光片组的形式来使用的。荧光滤光片组一般由三个透镜组成：激发滤光片（EX）、二向色镜和发射滤光片(EM)，他们都至于滤光片盒中（Cube），具体结构如下图所示，

激光滤光片的作用是使激发光能够有效的通过，而避免外界荧光波段的光线进入滤光片盒，二向色镜的作用主要是分光，反射激光使其照射样品，同时又能够让样品产生的荧光通过，达到发射滤光片，发射滤光片的作用是进一步滤掉激发光和其它杂散光，使系统得到比较纯粹的荧光信号。

5，优秀滤光片的特征

1）和染料的激发峰、发射峰匹配，且交叠小

2）截止深度深

3）自发荧光小

4）透镜面形好，利于荧光成像的提取。如果透镜表面的平整度不好，则会产生波前扭矩或楔角，波前扭矩会改变聚焦或成像位置，一般透射波前扭矩（TWD）比反射波前扭矩（RWD）对成像的影响更加直接，也会有更严格的要求。

6，滤光片的选择

  荧光滤波片选取的原则是在成像端尽可能让荧光/发射光透过，同时完全阻挡激发光，获得最高的信噪比。尤其是对于多光子激发和全内反射显微镜的应用，微弱的噪声也会对成像效果造成很大的干扰，因此对信噪比的要求更高。通常我们看滤光片的参数一般会看透射率光谱，但往往荧光相对于激发光的强度很弱，选择滤光片更需要参考阻挡深度光谱图——OD 值。OD 值更能直观地反映滤光片对光的阻挡特性。

  在选择激发滤光片和发射滤光片时，两者的阻挡深度光谱交点（OD 交点）是重要的判断标准，一般要求宽场光源激发是交点OD 值大于5，激光激发时大于OD6，以实现较好的荧光信噪比。

  有时激发和发射滤光片（EX 和EM 滤光片）的透射光谱组合看起来很完美，但转换成OD 值之后却发现光谱交点仅为OD1，不符合荧光成像的基本要求。因此，一般会建议激发和发射滤光片的透射光谱有一定的距离，比如10nm。